A little bit of RNA-SEQ (1/n)

RNA-Seq是一种测序方法,最先发明这种方法的目的是为了测定组织或者细胞内基因的表达量。后来这种技术又兼具了探索gene space和SNP鉴定的任务,尤其在没有可参考的基因组的情况下。传统RNA-Seq的基本过程是通过一定的实验手段将所需测序的RNA进行富集,如mRNA,然后将RNA反转录成cDNA,再对cDNA进行测序。现在比较新的RNA-Seq方法分别在样本提取和cDNA进行了改进,即单细胞测序(样本)和直接测序RNA(dRNA-Seq)。单细胞测序的一类衍生做法是使用组织冷冻切片,从而确定基因表达的空间秩序,也有类似于原位杂交的测序手段。

不过由于RNA本身具有多种形式,又通过各种方式参与生命过程,因此,RNA-Seq的方法延伸到了研究RNA biology的许多方面。通过采取不同的手段对所关注的RNA进行富集,便可以获取不同RNA的序列。比如通过抗体吸附RNA聚合酶II而获得正在转录中的RNA,可以更好的获得5’RNA并比较好的确定转录起始位。通过高速离心的方法区分富有核糖体和少有核糖体的mRNA,以研究RNA和翻译之间的关系(假设是核糖体的数量与翻译量正相关)。也可以通过富集RNA的结构片段或其与其他RNA及蛋白质相互作用的部分,从而获得与RNA结构和相互作用的结果。

RNA-Seq的每一步都有很多陷阱和不确定性。过去因为测序成本太高,可能产生了许多不尽如人意的数据。在常规的DGE分析中,有几个比较常见的偏差,比如RNA的降解使的测得的片段偏向3‘。破碎后片段中GC含量会导致PCR效率不同,高GC含量的片段PCR效率比较低,导致最终reads里这类片段比较少。合成cDNA时,又是会使用random hexmer primers,但其与RNA的结合效率不同,所以起始测序位点的核酸频率会出现偏差。

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