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理想状态下，人们进行基因表达量的比较分析时，希望比较的应该是任意两个细胞之间基因表达量的绝对差异，虽然这是一种resolution最高的状态。然而，实际在比较的时候，比较的是基因的相对表达量。对于qRT-PCR，是一个基因对应于内参(endogenous control)的表达在两个样本中的差异，endogenous control一般选取表达量不太高的基因。对于RNA-Seq来说，是一个基因在两个样本中proportion的差异。因此，这里其实暗含的假设是：两个样本间的转录组大小不能有巨大的变化。这个假设被分解成两个经常被提及的假设，即：

1. 大多数基因的表达量没有发生变化
2. 高表达量的基因的表达量没有发生变化

不过，这个假设其实往往是不成立的，无论是在样本本身，或是制备及测序过程中，都可能引入偏差。样本本身的问题是相对最难控制的，比如在比较二倍体和多倍体时，这就是个不能忽略的问题。现在通用的计算表达量的方法，很明显的就是在计算一个proportion。

通常用于计算RNA-Seq表达量时，主要考虑的是测序深度和基因长度。RPKM和FPKM分别对应于single-end和pair-end sequencing。FPKM只是对于pair-end reads无论两个片段都map到还是一个片段map到基因上，都算成一次mapped fragment。这两者的具体做法就是把基因上reads/fragments的数量先处以所有map到的reads的数量，然后再处以基因长度。所以RPKM和FPKM是名字是很误导人的，准确的说应该是Reads (Fragements) per Million reads per Kilobase。

另外一种更流行的做法时TPM，具体的做法其实只是先除以基因的长度，再处以所有mapped reads数量，这样各个样本表达量的总和就会是相同的数值（即100%）。但TPM的全名更没有实际意义，Transcripts Per Million（RNA-Seq领域起名都很随意而没有实际意义)。

RNA-Seq是一种测序方法，最先发明这种方法的目的是为了测定组织或者细胞内基因的表达量。后来这种技术又兼具了探索gene space和SNP鉴定的任务，尤其在没有可参考的基因组的情况下。传统RNA-Seq的基本过程是通过一定的实验手段将所需测序的RNA进行富集，如mRNA，然后将RNA反转录成cDNA，再对cDNA进行测序。现在比较新的RNA-Seq方法分别在样本提取和cDNA进行了改进，即单细胞测序(样本)和直接测序RNA(dRNA-Seq)。单细胞测序的一类衍生做法是使用组织冷冻切片，从而确定基因表达的空间秩序，也有类似于原位杂交的测序手段。

不过由于RNA本身具有多种形式，又通过各种方式参与生命过程，因此，RNA-Seq的方法延伸到了研究RNA biology的许多方面。通过采取不同的手段对所关注的RNA进行富集，便可以获取不同RNA的序列。比如通过抗体吸附RNA聚合酶II而获得正在转录中的RNA，可以更好的获得5’RNA并比较好的确定转录起始位。通过高速离心的方法区分富有核糖体和少有核糖体的mRNA，以研究RNA和翻译之间的关系(假设是核糖体的数量与翻译量正相关)。也可以通过富集RNA的结构片段或其与其他RNA及蛋白质相互作用的部分，从而获得与RNA结构和相互作用的结果。

RNA-Seq的每一步都有很多陷阱和不确定性。过去因为测序成本太高，可能产生了许多不尽如人意的数据。在常规的DGE分析中，有几个比较常见的偏差，比如RNA的降解使的测得的片段偏向3‘。破碎后片段中GC含量会导致PCR效率不同，高GC含量的片段PCR效率比较低，导致最终reads里这类片段比较少。合成cDNA时，又是会使用random hexmer primers，但其与RNA的结合效率不同，所以起始测序位点的核酸频率会出现偏差。